La possibilità di analizzare e determinare microrganismi, quali batteri e lieviti, in maniera rapida e riproducibile, suscita notevole interesse scientifico data la loro versatilità nel campo della ricerca e dell’industria. Rispetto alle classiche tecniche impiegate in microbiologia, i metodi basati sull’elettroforesi capillare appaiono a tutt'oggi alquanto promettenti poiché in grado non solo di separare con elevata efficienza molecole, ma anche particelle colloidali e quindi cellule. In particolari condizioni, infatti, le cellule microbiche evidenziano in superficie una propria carica netta, grazie alla composizione della loro parete cellulare, e conseguentemente si comportano alla stregua dei colloidi [1,2] il ché rende possibile la loro analisi elettroforetica [2-4]. Nella presente attività di ricerca è stato messo a punto un originale metodo di analisi basato su elettroforesi capillare con rivelazione a diode array applicato alla caratterizzazione di ceppi di lievito Saccharomyces cerevisiae. L'implementazione della metodica ha previsto l'ottimizzazione di una serie di parametri elettroforetici quali ad es. la viscosità del tampone di corsa, il volume di campione e l’intensità del campo elettrico applicato. Successivamente si è focalizzato l’interesse sullo studio del comportamento elettroforetico di diversi ceppi di Saccharomyces cerevisiae cresciuti in terreno liquido YPD (Yeast extract, Peptone, D-glucose). Lo studio ha evidenziato una variabilità significativa dei profili elettroforetici, imputata alle differenti velocità di crescita di ciascun ceppo. In particolare, la crescita del ceppo selvaggio 4LBI3 ha evidenziato, inoltre, che esiste una relazione tra il profilo elettroforetico e la fase di crescita in cui si trova la popolazione cellulare esaminata. L’analisi delle dimensioni cellulari mediante microscopia ottica ha evidenziato infine una correlazione tra il profilo elettroforetico del campione e l’effettiva eterogeneità dimensionale della popolazione cellulare analizzata. I risultati sperimentali ottenuti dimostrano la validità dell’elettroforesi capillare per lo studio delle dinamiche di crescita dei lieviti e ne incoraggiano una futura applicazione per analisi quantitative anche di altre specie microbiche. [1] Radko S.P., Chrambach A., Electrophoresis, (2002) 23: pp. 1957-1972 [2] Rodriguez M.A., Armstrong D.W., J. of Chromatography B, 800, 7 (2004). [3] Armstrong D.W., Girod L.H., Rodriguez M.A. et al., Analy. Chem., 74, 5523 (2002). [4] Armstrong D.W., Schulte G., Schneiderheinze J.M., Westenberg D.J., Anal. Chem., 71, 5465 (1999).

Impiego dell'elettroforesicapillare per la caratterizzazione di microrganismi: l'analisi di ceppi di Saccharomyces cerevisiae

CAPECE, Angela;CIRIELLO, Rosanna;GUERRIERI, Antonio;ROMANO, Patrizia
2010

Abstract

La possibilità di analizzare e determinare microrganismi, quali batteri e lieviti, in maniera rapida e riproducibile, suscita notevole interesse scientifico data la loro versatilità nel campo della ricerca e dell’industria. Rispetto alle classiche tecniche impiegate in microbiologia, i metodi basati sull’elettroforesi capillare appaiono a tutt'oggi alquanto promettenti poiché in grado non solo di separare con elevata efficienza molecole, ma anche particelle colloidali e quindi cellule. In particolari condizioni, infatti, le cellule microbiche evidenziano in superficie una propria carica netta, grazie alla composizione della loro parete cellulare, e conseguentemente si comportano alla stregua dei colloidi [1,2] il ché rende possibile la loro analisi elettroforetica [2-4]. Nella presente attività di ricerca è stato messo a punto un originale metodo di analisi basato su elettroforesi capillare con rivelazione a diode array applicato alla caratterizzazione di ceppi di lievito Saccharomyces cerevisiae. L'implementazione della metodica ha previsto l'ottimizzazione di una serie di parametri elettroforetici quali ad es. la viscosità del tampone di corsa, il volume di campione e l’intensità del campo elettrico applicato. Successivamente si è focalizzato l’interesse sullo studio del comportamento elettroforetico di diversi ceppi di Saccharomyces cerevisiae cresciuti in terreno liquido YPD (Yeast extract, Peptone, D-glucose). Lo studio ha evidenziato una variabilità significativa dei profili elettroforetici, imputata alle differenti velocità di crescita di ciascun ceppo. In particolare, la crescita del ceppo selvaggio 4LBI3 ha evidenziato, inoltre, che esiste una relazione tra il profilo elettroforetico e la fase di crescita in cui si trova la popolazione cellulare esaminata. L’analisi delle dimensioni cellulari mediante microscopia ottica ha evidenziato infine una correlazione tra il profilo elettroforetico del campione e l’effettiva eterogeneità dimensionale della popolazione cellulare analizzata. I risultati sperimentali ottenuti dimostrano la validità dell’elettroforesi capillare per lo studio delle dinamiche di crescita dei lieviti e ne incoraggiano una futura applicazione per analisi quantitative anche di altre specie microbiche. [1] Radko S.P., Chrambach A., Electrophoresis, (2002) 23: pp. 1957-1972 [2] Rodriguez M.A., Armstrong D.W., J. of Chromatography B, 800, 7 (2004). [3] Armstrong D.W., Girod L.H., Rodriguez M.A. et al., Analy. Chem., 74, 5523 (2002). [4] Armstrong D.W., Schulte G., Schneiderheinze J.M., Westenberg D.J., Anal. Chem., 71, 5465 (1999).
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