La determinazione dell’aminoacido essenziale L-lisina è di particolare interesse in campo biochimico, biotecnologico ed alimentare poichè, ad es., i suoi livelli sono in genere associabili, rispettivamente, a talune disfunzioni patologiche ed alle qualità nutrizionali di un prodotto alimentare. In questo contesto, l’impiego di metodi enzimatici specifici, basati su elettrodi ad enzima immobilizzato, costituisce certamente una valida alternativa alle metodiche analitiche convenzionali. Diversi biosensori per la determinazione della lisina sono descritti in letteratura. White e Guilbault [1] hanno esplorato la determinazione potenziometrica della lisina accoppiando elettrodi a CO2 con la lisina-decarbossilasi mentre Dempsey et al. [2] hanno sviluppato un biosensore amperometrico immobilizzando la lisina-deidrogenasi su elettrodi di Pt. Sfortunatamente, il metodo potenziometrico è limitato dall’interferenza dovuta alla CO2 atmosferica che ne riduce notevolmente la sensibilità mentre il secondo necessita la presenza dell’NAD+ come cofattore e di un mediatore in soluzione. Conseguentemente, l’approccio più efficiente risulta essere quello amperometrico basato sull’impiego della L-lisina-α-ossidasi che catalizza l’ossidazione dell’aminoacido ad α-cheto-ε-aminocaproato, ione ammonio ed acqua ossigenata. Nella realizzazione di un biosensore è preliminare lo sviluppo e l’ottimizzazione di una metodica di immobilizzazione enzimatica efficiente, in grado di assicurare un notevole grado di stabilità dell’enzima immobilizzato ed elevate attività. Diverse tecniche di immobilizzazione sono state esplorate per la lisina ossidasi quali ad es. l’immobilizzazione covalente su nylon [3] o membrane preattivate [4], l’intrappolamento in collagene [5], il crosslinking [6] o il co-crosslinking [7] dell’enzima su elettrodi di Pt modificati con 1,2-diaminobenzene. In particolare, il co-crosslinking è una tecnica di immobilizzazione particolarmente versatile e vantaggiosa in quanto applicabile ad una vasta gamma di enzimi e facilmente adattabile alle geometrie elettrodiche usualmente utilizzate nei rivelatori elettrochimici in batch ed in flusso. Biosensori per colina ed acetilcolina [8], ad es., sono stati realizzati immobilizzando il sistema bienzimatico acetilcolinesterasi/colina ossidasi su elettrodi di Pt mediante co-crosslinking con albumina di siero bovina e glutaraldeide; ancora, lo stesso approccio ha permesso la realizzazione di un biosensore interference and fouling-free per il glucosio [9] basato su un doppio strato costituito da glucosio ossidasi co-crosslinked e polipirrolo overossidato. Nel laboratorio degli autori è stato di recente messo a punto un nuovo biosensore per la determinazione della lisina in campioni di interesse farmacologico ed alimentare basato su co-crosslinking della lisina ossidasi con una proteina inerte quale l’albumina di siero bovino e la glutaraldeide come crosslinker. Uno studio delle concentrazioni ottimali di enzima, proteina inerte e crosslinker ha permesso la realizzazione su elettrodi di Pt di una membrana ad elevata attività enzimatica ed al tempo stesso meccanicamente stabile tanto da permetterne l’applicazione per analisi in flusso. Il sensore così realizzato ha evidenziato un valore di sensibilità relativamente elevato, pari a circa 1.4 µA/mM mm2, un range lineare esteso sino a circa 0.6 mM, un breve tempo di risposta (6-7 secondi) ed una stabilità tale da consentire un impiego in continuo per più di 40 giorni senza apprezzabile variazione della sensibilità. Una caratterizzazione elettroanalitica del biosensore ha consentito di stimare un valore di KM apparente pari a circa 2.1 ± 0.2 mM ed, al tempo stesso, ha evidenziato uno spiccato controllo diffusivo, difficilmente riscontrabile nei dispositivi basati sulla immobilizzazione elettrochimica. In particolare, questo studio ha messo in evidenza la possibilità di modulare il comportamento cinetico dell’elettrodo da diffusivo a enzimatico variando il pH dell’elettrolita di supporto. E’ possibile quindi nel presente caso ottimizzare le performances del biosensore senza modificare variabili complesse quali la concentrazione dell’enzima immobilizzato e lo spessore e la permeabilità al substrato della membrana enzimatica. Nonostante gli enzimi siano notoriamente specifici nei confronti di un singolo substrato, la lisina-ossidasi catalizza in soluzione, seppur con rese inferiori, anche l’ossidazione di altri aminoacidi [10], quali l’ornitina, la fenilalanina e l’arginina, che potrebbero interferire nella determinazione della lisina. Sebbene l’approccio più usuale per ovviare a questo inconveniente sia quello di selezionare la fonte dell’enzima [7] in base alla sua maggiore specificità, il presente studio ha evidenziato che un opportuno controllo cinetico del sensore, variando il pH e/o la velocità di flusso, permette con un comune enzima commerciale specificità ottimali se non migliori a quelle riscontrabili con enzimi selezionati da fonti opportune. La codeposizione sull’elettrodo di un polimero permselettivo elettrosintetizzato [9], ha infine permesso la realizzazione di un biosensore per L-lisina, scevro da interferenza ed avvelenamento, tramite elettrodeposizione di una membrana polimerica permselettiva basata su polipirrolo overossidato. Riferimenti 1. W. C. White, G. Guilbault, Anal. Chem., 50 (1978) 1481 2. E. Dempsey, J. Wang, V. Wollenberg, M. Ozsos, M. R. Smith, Biosensors and Bioelectronics, 7 (1992) 323 3. E. Vrbovà e M. Marek, Anal. Chim. Acta, 239 (1990) 263 4. M. G. Lavagnini, D. Moscone, G. Palleschi, D. Compagnone, C. Cremisini, Talanta, 40(8) (1993) 1301 5. E. Vrbovà e M. Marek, Collect. Czech. Chem. Commun., 55 (1990) 2568 6. A. Curulli, S. Kelly, C. O’Sullivan, G. G. Guilbaut, G. Palleschi, Biosensors and Bioelectronics 13 (1998) 1245 7. S. C. Kelly, P. J. O’Connell, C. K. O’Sullivan, G. G. Guilbaut, , Anal. Chim. Acta, 412 (2000) 111 8. A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Analyst, 120 (1995) 2731 9. A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Biosensors & Bioelectronics, 13 (1) (1998) 103 10. H. Kusakabe, K. Kodama, A. Kuminaka, H. Yoshimo, H. Misono, K. Soda, J. Biol. Chem., 255 (1980) 976

Biosensore amperometrico per la L-lisina basato su co-crosslinking di lisina-ossidasi su elettrodi di Pt modificati con polipirrolo overossidato

CIRIELLO, Rosanna;GUERRIERI, Antonio
2001

Abstract

La determinazione dell’aminoacido essenziale L-lisina è di particolare interesse in campo biochimico, biotecnologico ed alimentare poichè, ad es., i suoi livelli sono in genere associabili, rispettivamente, a talune disfunzioni patologiche ed alle qualità nutrizionali di un prodotto alimentare. In questo contesto, l’impiego di metodi enzimatici specifici, basati su elettrodi ad enzima immobilizzato, costituisce certamente una valida alternativa alle metodiche analitiche convenzionali. Diversi biosensori per la determinazione della lisina sono descritti in letteratura. White e Guilbault [1] hanno esplorato la determinazione potenziometrica della lisina accoppiando elettrodi a CO2 con la lisina-decarbossilasi mentre Dempsey et al. [2] hanno sviluppato un biosensore amperometrico immobilizzando la lisina-deidrogenasi su elettrodi di Pt. Sfortunatamente, il metodo potenziometrico è limitato dall’interferenza dovuta alla CO2 atmosferica che ne riduce notevolmente la sensibilità mentre il secondo necessita la presenza dell’NAD+ come cofattore e di un mediatore in soluzione. Conseguentemente, l’approccio più efficiente risulta essere quello amperometrico basato sull’impiego della L-lisina-α-ossidasi che catalizza l’ossidazione dell’aminoacido ad α-cheto-ε-aminocaproato, ione ammonio ed acqua ossigenata. Nella realizzazione di un biosensore è preliminare lo sviluppo e l’ottimizzazione di una metodica di immobilizzazione enzimatica efficiente, in grado di assicurare un notevole grado di stabilità dell’enzima immobilizzato ed elevate attività. Diverse tecniche di immobilizzazione sono state esplorate per la lisina ossidasi quali ad es. l’immobilizzazione covalente su nylon [3] o membrane preattivate [4], l’intrappolamento in collagene [5], il crosslinking [6] o il co-crosslinking [7] dell’enzima su elettrodi di Pt modificati con 1,2-diaminobenzene. In particolare, il co-crosslinking è una tecnica di immobilizzazione particolarmente versatile e vantaggiosa in quanto applicabile ad una vasta gamma di enzimi e facilmente adattabile alle geometrie elettrodiche usualmente utilizzate nei rivelatori elettrochimici in batch ed in flusso. Biosensori per colina ed acetilcolina [8], ad es., sono stati realizzati immobilizzando il sistema bienzimatico acetilcolinesterasi/colina ossidasi su elettrodi di Pt mediante co-crosslinking con albumina di siero bovina e glutaraldeide; ancora, lo stesso approccio ha permesso la realizzazione di un biosensore interference and fouling-free per il glucosio [9] basato su un doppio strato costituito da glucosio ossidasi co-crosslinked e polipirrolo overossidato. Nel laboratorio degli autori è stato di recente messo a punto un nuovo biosensore per la determinazione della lisina in campioni di interesse farmacologico ed alimentare basato su co-crosslinking della lisina ossidasi con una proteina inerte quale l’albumina di siero bovino e la glutaraldeide come crosslinker. Uno studio delle concentrazioni ottimali di enzima, proteina inerte e crosslinker ha permesso la realizzazione su elettrodi di Pt di una membrana ad elevata attività enzimatica ed al tempo stesso meccanicamente stabile tanto da permetterne l’applicazione per analisi in flusso. Il sensore così realizzato ha evidenziato un valore di sensibilità relativamente elevato, pari a circa 1.4 µA/mM mm2, un range lineare esteso sino a circa 0.6 mM, un breve tempo di risposta (6-7 secondi) ed una stabilità tale da consentire un impiego in continuo per più di 40 giorni senza apprezzabile variazione della sensibilità. Una caratterizzazione elettroanalitica del biosensore ha consentito di stimare un valore di KM apparente pari a circa 2.1 ± 0.2 mM ed, al tempo stesso, ha evidenziato uno spiccato controllo diffusivo, difficilmente riscontrabile nei dispositivi basati sulla immobilizzazione elettrochimica. In particolare, questo studio ha messo in evidenza la possibilità di modulare il comportamento cinetico dell’elettrodo da diffusivo a enzimatico variando il pH dell’elettrolita di supporto. E’ possibile quindi nel presente caso ottimizzare le performances del biosensore senza modificare variabili complesse quali la concentrazione dell’enzima immobilizzato e lo spessore e la permeabilità al substrato della membrana enzimatica. Nonostante gli enzimi siano notoriamente specifici nei confronti di un singolo substrato, la lisina-ossidasi catalizza in soluzione, seppur con rese inferiori, anche l’ossidazione di altri aminoacidi [10], quali l’ornitina, la fenilalanina e l’arginina, che potrebbero interferire nella determinazione della lisina. Sebbene l’approccio più usuale per ovviare a questo inconveniente sia quello di selezionare la fonte dell’enzima [7] in base alla sua maggiore specificità, il presente studio ha evidenziato che un opportuno controllo cinetico del sensore, variando il pH e/o la velocità di flusso, permette con un comune enzima commerciale specificità ottimali se non migliori a quelle riscontrabili con enzimi selezionati da fonti opportune. La codeposizione sull’elettrodo di un polimero permselettivo elettrosintetizzato [9], ha infine permesso la realizzazione di un biosensore per L-lisina, scevro da interferenza ed avvelenamento, tramite elettrodeposizione di una membrana polimerica permselettiva basata su polipirrolo overossidato. Riferimenti 1. W. C. White, G. Guilbault, Anal. Chem., 50 (1978) 1481 2. E. Dempsey, J. Wang, V. Wollenberg, M. Ozsos, M. R. Smith, Biosensors and Bioelectronics, 7 (1992) 323 3. E. Vrbovà e M. Marek, Anal. Chim. Acta, 239 (1990) 263 4. M. G. Lavagnini, D. Moscone, G. Palleschi, D. Compagnone, C. Cremisini, Talanta, 40(8) (1993) 1301 5. E. Vrbovà e M. Marek, Collect. Czech. Chem. Commun., 55 (1990) 2568 6. A. Curulli, S. Kelly, C. O’Sullivan, G. G. Guilbaut, G. Palleschi, Biosensors and Bioelectronics 13 (1998) 1245 7. S. C. Kelly, P. J. O’Connell, C. K. O’Sullivan, G. G. Guilbaut, , Anal. Chim. Acta, 412 (2000) 111 8. A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Analyst, 120 (1995) 2731 9. A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Biosensors & Bioelectronics, 13 (1) (1998) 103 10. H. Kusakabe, K. Kodama, A. Kuminaka, H. Yoshimo, H. Misono, K. Soda, J. Biol. Chem., 255 (1980) 976
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