Un biosensore a doppio elettrodo per la determinazione simultanea di fosfocolina e colina in flusso

La colina (Ch) ed i metaboliti ad essa correlati, ad esempio la fosfocolina (PCh), fungono da substrati in molti dei principali percorsi bio-metabolici. L’applicazione della spettroscopia NMR alla scienza medica ha consentito di documentare l’esistenza di una correlazione tra la concentrazione dei composti della Ch e patologie di vario genere quali neoplasmi e disturbi neurodegenerativi. Le usuali metodiche NMR, già di per sé di non facile utilizzo, consentono la misurazione in vivo o ex vivo della sola concentrazione totale di questi metaboliti. Sono state, quindi, di recente sviluppate tecniche NMR multinucleari in cui grazie alla correlazione tra 1H e 31P si è riusciti a distinguere ex vivo la Ch dalla PCh [1]. La mancanza di metodiche analitiche più semplici deriva dalla difficoltà a rivelare specie, quali la Ch ed i suoi metaboliti, sprovviste di gruppi elettroattivi o cromofori. Nel laboratorio degli autori è stato di recente realizzato un sensore amperometrico bienzimatico a fosfatasi alcalina (ALP) - colina ossidasi (ChO) co-immobilizzate per l’analisi integrata di Ch e PCh in flusso. Nell’ipotesi di voler discriminare il contributo dei due analiti, è necessaria però la loro preliminare separazione mediante HPLC poiché lo schema di rivelazione adottato prevede che la PCh debba essere convertita in Ch per poter essere rivelata [2]. Lo scopo del presente lavoro di ricerca è stato quello di consentire la determinazione simultanea di Ch e PCh nello stesso dispositivo fisico, e cioè a livello del rivelatore, senza dover ricorrere allo step cromatografico. Ciò è stato possibile grazie all’utilizzo di un elettrodo doppio a ChO e a ChO-ALP immobilizzate. Poiché entrambi i sensori rivelano perossido di idrogeno è stato necessario innanzitutto verificare l’assenza di effetti del tipo “cross-talk” [3]. L’analisi di miscele di Ch e PCh nell’intervallo lineare di concentrazione ha evidenziato la specificità dell’elettrodo monoenzimatico alla sola Ch mentre per l’elettrodo bienzimatico il responso globale è risultato additivo. A valori più elevati di concentrazione si è osservata inoltre a carico della PCh una inibizione di tipo non competitivo sulla ChO. Infine, l’impiego di uno strato permselettivo di polipirrolo overossidato ha consentito la realizzazione di un dispositivo esente da problemi di interferenza faradica. I valori di bias sperimentati su Ch e PCh ad opera di comuni sostanze elettroattive sono risultati infatti confrontabili se non inferiori ai limiti di rivelabilità pari a 2.7 µM per PCh e 0.19 µM per Ch (S/N=3). Riferimenti bibliografici 1. Loening, N.M.; Chamberlin, A.M.; Zepeda, A.G.; Gonzalez, R.G.; Cheng, L.L. NMR in Biomedicine 2005, 18(7), 413-420. 2. Guerrieri, A.; Palmisano, F. Anal. Chem. 2001, 73, 2875-2872. 3. Guerrieri, A.; Lattanzio, V.; Palmisano, F.; Zambonin P.G. Bios. & Bioelec. 2006, 21, 1710-1718.