Dosaggio delle colinesterasi nei fluidi biologici mediante un nuovo biosensore amperometrica a colina ossidasi modificato con polipirrolo overossidato

Le colinesterasi sono una famiglia di enzimi presenti negli organismi viventi in grado di catalizzare l’idrolisi degli esteri della colina. Nell’uomo esistono due specie di colinesterasi: l’acetilcolinesterasi, presente principalmente nelle sinapsi nervose e negli eritrociti, e la butirrilcolinesterasi presente nel fegato, nel miocardio, nel pancreas, nel siero e nella sostanza bianca del cervello. Sebbene entrambi gli enzimi abbiano importanza fisiologica, l’enzima sierico mostra maggior interesse clinico. La determinazione dei livelli della pseudocolinesterasi viene in genere effettuata come test di funzionalità epatica o per la diagnosi di avvelenamento da insetticidi. Lo screening preoperatorio della colinesterasi permette, inoltre, di riconoscere i pazienti con varianti atipiche dell’enzima, evitando quindi un’apnea prolungata causata dalla demolizione più lenta dei farmaci miorilassanti. La procedura di riferimento per il dosaggio della pseudocolinesterasi nel siero è il saggio spettrofotometrico di Ellman che utilizza un estere della tiocolina come substrato e il DTNB (acido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico) come cromoforo [1]. Tale metodo, quantunque sensibile e riproducibile, richiede tempi di analisi lunghi, una strumentazione relativamente complessa ed ingombrante e non può essere impiegato né per la determinazione dei livelli di acetilcolinesterasi nei globuli rossi, né per quella dell’attività totale delle colinesterasi nel sangue, in quanto sostanze quali l’emoglobina e il glutatione presenti negli eritrociti interferiscono nel saggio. Lo scopo del presente lavoro di ricerca è stato quello di realizzare un dispositivo analitico avanzato per il dosaggio delle colinesterasi che costituisse una valida alternativa alle metodiche convenzionali. In particolare si è sviluppato un biosensore amperometrico basato su immobilizzazione di colina ossidasi mediante la tecnica del co-crosslinking enzimatico su un elettrodo di platino precedentemente modificato con un film di polipirrolo overossidato dalle spiccate caratteristiche permselettive [2]. L’immobilizzazione dell’enzima colina ossidasi mediante co-crosslinking è già stata riportata in letteratura nel caso di un sensore bienzimatico per la rivelazione di colina ed acetilcolina realizzato co-immobilizzando, con tale tecnica, colina ossidasi ed acetilcolinesterasi su elettrodi di platino [3, 4]. In letteratura esistono già diversi esempi di biosensori a colina ossidasi per il dosaggio della colinesterasi [5-8]. Ad es. Palleschi e collaboratori [8] hanno realizzato un sensore multimembrana composto da uno strato anti-interferente di acetato di cellulosa a contatto con l’elettrodo, una membrana di nylon contenente colina ossidasi immobilizzata covalentemente ed una membrana per dialisi in grado di proteggere il sensore da adsorbimento di altri enzimi o da attacco microbico. L’impiego di un biosensore amperometrico basato su co-crosslinking enzimatico accoppiato ad elettrosintesi di un film permselettivo, quale quello adottato nel presente lavoro, è sicuramente di più facile realizzazione rispetto ai sensori multimembrana ed inoltre assicura tempi di risposta brevi e al contempo notevoli proprietà di anti-avvelenamento ed anti-interferenza. La caratterizzazione elettroanalitica del biosensore in oggetto ha evidenziato un valore di sensibilità per la colina pari a circa 0.29 A/mM mm2, un range lineare esteso fino a circa 0.5 mM, un breve tempo di risposta (3-4 secondi), un limite di rivelabilità di 1 M ed una stabilità tale da consentire un impiego in continuo per più di 40 giorni senza apprezzabile variazione della sensibilità. E’ stato inoltre stimato per il sensore un valore di KM apparente pari a circa 2.18 ± 0.06 mM. Il biosensore, infine, è risultato immune da problemi relati ad avvelenamento elettrodico e interferenza faradica generata dai più comuni interferenti (ad es. ascorbato, urato, cisteina) presenti nel siero. La determinazione dell’attività delle colinesterasi prevede l’impiego del biosensore in configurazione elettrodo rotante, l’aggiunta di un estere della colina nella soluzione da analizzare e la successiva introduzione del campione o di uno standard di colinesterasi (acetil o butirrilcolinesterasi). Al fine di ottimizzare il responso del sensore nei confronti dell’enzima da dosare, è stato condotto uno studio di taluni parametri di analisi quali la velocità di rotazione dell’elettrodo, il pH della soluzione tampone e la concentrazione del substrato della colinesterasi. L’ottimizzazione delle prestazioni del biosensore ha consentito di ottenere per le varie coppie enzima/substrato curve di calibrazione caratterizzate da apprezzabile sensibilità ed intervallo di linearità esteso. I risultati sperimentali sin qui ottenuti incoraggiano un futuro impiego del biosensore per il dosaggio delle colinesterasi in campioni reali quali i fluidi biologici e la realizzazione di un dispositivo analitico più avanzato di tipo “disposable”. [1] G. L. Ellman et al. Biochem. Pharmacol. 7 (1961) 88-95 [2] A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin Biosensors & Bioelectronics 13 (1) (1998) 103-112 [3] A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin The Analyst 120 (1995) 2731-2736 [4] A. Guerrieri, F. Palmisano Analytical Chemistry 73(13) (2001) 2875-2882 [5] F. Mizutani, K. Tsuda Analytica Chimica Acta 139 (1982) 359-362 [6] E. Navera, M. Suzuki, K. Yokoyama, E. Tamiya, T. Takeuchi, I. Karube Analytica Chimica Acta 281 (1993) 673-679 [7] T. Katsu, T. Kayamoto Analytica Chimica Acta 254 (1991) 95-97 [8] G. Palleschi, M. G. Lavagnini, D. Moscone, R. Pilloton Biosensors & Bioelectronics 5 (1990) 27-35