Il metabolismo della colina è importante nella regolazione di processi cellulari basilari quali la morfogenesi, la mitosi, la fusione cellulare, l’apoptosi di epatociti e lo sviluppo di neuroni [1]. La fosfocolina, metabolita idrosolubile della colina, è il precursore di un importante componente delle membrane cellulari quali la fosfatidilcolina. Di recente è emerso come la fosfocolina sia coinvolta nella regolazione della mitogenesi e della carcinogenesi [2]. In particolare si è osservato che i tessuti affetti da forme tumorali di natura maligna contengono, rispetto ai tessuti normali, livelli di fosfocolina più elevati. Nel caso del cancro al seno, ad esempio, le cellule mammarie sono caratterizzate da un contenuto di fosfocolina almeno dieci volte superiore rispetto alle cellule epiteliali normali [3]. Tale marcata differenza sembra sia dovuta principalmente ad una elevata velocità di trasporto della colina unitamente ad una elevata attività dell’enzima colina chinasi, responsabile della produzione di fosfocolina a partire dalla colina [4]. La determinazione dei livelli di fosfocolina è inoltre importante nel caso di patologie neurodegenerative quali il morbo di Alzheimer per le quali si riscontrano livelli elevati dei metaboliti correlati alla fosfatidilcolina (fosfocolina, glicerofosfocolina e colina) nel fluido cerebrospinale [5]. Le metodologie convenzionali sviluppate sin ora per la determinazione della fosfocolina in campioni biologici sono complesse e spesso richiedono strumentazioni particolari il che preclude la possibilità di analisi di routine nei comuni laboratori. Sono state messe a punto ad esempio metodiche che sfruttano la gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa, previa derivatizzazione dell’analita [6], la cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelatore elettrochimico accoppiata ad una colonna ad enzima immobilizzato [7], metodi radioenzimatici [8], la spettroscopia NMR multinucleare [9] o ancora tecniche del tipo imaging TOF-SIMS [10]. In questo contesto i biosensori elettrochimici giocano un ruolo decisamente innovativo ed assai promettente essendo caratterizzati da bassi costi di utilizzo e facilità di impiego. Nel presente lavoro di ricerca è stato realizzato un sensore amperometrico bienzimatico per il dosaggio della fosfocolina basato sulla co-immobilizzazione della fosfatasi alcalina e della colina ossidasi su un elettrodo di platino mediante la tecnica del co-crosslinking enzimatico. La realizzazione di un sensore bienzimatico mediante co-crosslinking è già stata riportata nel caso di un dispositivo sviluppato per la determinazione di colina ed aceticolina co-immobilizzando colina ossidasi ed acetilcolinesterasi su elettrodo di platino tal quale [11, 12] o modificato con film polimerici elettrosintetizzati [13]. Allo scopo di ottimizzare il responso del sensore nei confronti della fosfocolina si è reso necessario uno studio preliminare sulle prestazioni del biosensore al variare della fonte di fosfatasi alcalina. Tale enzima infatti idrolizza in modo non specifico monoesteri dell’acido ortofosforico a valori di pH alcalini per produrre fosfato inorganico ed un alcool, nella fattispecie colina. Sono state testate varie forme di fosfatasi alcalina, derivanti da diverse sorgenti naturali e/o diversi organi, differenti per attività enzimatica specifica, e, a parità di forma, sono stati esplorati diversi rapporti di attività dei due enzimi nella soluzione di immobilizzazione, ottenendo biosensori caratterizzati da diverse prestazioni in termini di sensibilità, valori di corrente massima, costante di Michaelis-Menten apparente e stabilità. Tra tutti i dispositivi realizzati, il biosensore che ha evidenziato le migliori performances analitiche per la fosfocolina è stato applicato all’analisi in flusso fornendo un limite di rivelabilità per colina e fosfocolina pari a 0.1 µM (S/N = 3) ed un intervallo di linearità esteso fino a 100 µM, valori più che adeguati per un futuro impiego del sensore per la determinazione della fosfocolina in campioni di interesse clinico diagnostico quali fluido cerebrospinale o omogeneizzati di tessuti. A tale scopo si è combinato il co-crosslinking enzimatico all’elettrosintesi di un film permselettivo sulla superficie elettrodica in grado di ovviare alle comuni problematiche di avvelenamento dell’elettrodo ed interferenza faradica. L’utilizzo di un rivelatore in flusso del tipo thin-layer a doppio elettrodo (configurazione parallela) [13], a colina ossidasi immobilizzata e a colina ossidasi/fosfatasi alcalina co-immobilizzate, consentirà la simultanea determinazione di colina e fosfocolina senza la necessità di ricorrere ad uno step cromatografico tipicamente richiesto per separare tali due sostanze. Riferimenti Bibliografici [1] O. H. Shin, M. H. Mar, C. D. Albright, M. T. Citarella, K. A Da Costa, S. H. Zeisel Journal of Cellular Biochemistry 64 (1997) 196-208 [2] Z. Kiss Cellular Signalling 11 (1999) 149-157 [3] Y. T. Ting, D. Sherr, H. Degani Anticancer Res 16 (1996) 1381–8 [4] R. Katz-Brull, H. Degani Anticancer Res 16 (1996) 1375–80 [5] A. Walter, U. Korth, M. Hilgert, J. Hartmann, O. Weichel, M. Hilgert, K. Fassbender, A. Schmitt, J. Klein Neurology of Agins 25 (2004) 1299-1303 [6] E. A. Pomfret, K. A. Da Costa, L. Schurman, S. H. Zeisel Analytical Biochemistry 180 (1989) 85-90 [7] S. Murai, H. Saito, R. Shirato, T. Kawaguchi Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 46 (2002) 103-109 [8] J. Murray, T. Dinh, A. Truett, D. Kennerly Biochemical Journal 270 (1990) 63-8 [9] R. Katz-Brull, R. Margalit, P. Bendel, H. Degani Magnetic Resonance materials in Biology, Physics and medicine 6 (1998) 44-52 [10] H. Nygren, K. Borner, B. Hagenhoff, P. Malmberg, J. E. Mansson Biochimica et Biophysica Acta 1737 (2005) 102-110 [11] A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin The Analyst 120 (1995) 2731-2736 [12] A. Guerrieri, F. Palmisano Analytical Chemistry 73 (2001) 2875-2882 [13] A. Guerrieri, V. Lattanzio, F. Palmisano, P.G. Zambonin Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 1710–1718

Determinazione della fosfocolina mediante biosensore a colina ossidasi/fosfatasi alcalina immobilizzati

CIRIELLO, Rosanna;GUERRIERI, Antonio
2007

Abstract

Il metabolismo della colina è importante nella regolazione di processi cellulari basilari quali la morfogenesi, la mitosi, la fusione cellulare, l’apoptosi di epatociti e lo sviluppo di neuroni [1]. La fosfocolina, metabolita idrosolubile della colina, è il precursore di un importante componente delle membrane cellulari quali la fosfatidilcolina. Di recente è emerso come la fosfocolina sia coinvolta nella regolazione della mitogenesi e della carcinogenesi [2]. In particolare si è osservato che i tessuti affetti da forme tumorali di natura maligna contengono, rispetto ai tessuti normali, livelli di fosfocolina più elevati. Nel caso del cancro al seno, ad esempio, le cellule mammarie sono caratterizzate da un contenuto di fosfocolina almeno dieci volte superiore rispetto alle cellule epiteliali normali [3]. Tale marcata differenza sembra sia dovuta principalmente ad una elevata velocità di trasporto della colina unitamente ad una elevata attività dell’enzima colina chinasi, responsabile della produzione di fosfocolina a partire dalla colina [4]. La determinazione dei livelli di fosfocolina è inoltre importante nel caso di patologie neurodegenerative quali il morbo di Alzheimer per le quali si riscontrano livelli elevati dei metaboliti correlati alla fosfatidilcolina (fosfocolina, glicerofosfocolina e colina) nel fluido cerebrospinale [5]. Le metodologie convenzionali sviluppate sin ora per la determinazione della fosfocolina in campioni biologici sono complesse e spesso richiedono strumentazioni particolari il che preclude la possibilità di analisi di routine nei comuni laboratori. Sono state messe a punto ad esempio metodiche che sfruttano la gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa, previa derivatizzazione dell’analita [6], la cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelatore elettrochimico accoppiata ad una colonna ad enzima immobilizzato [7], metodi radioenzimatici [8], la spettroscopia NMR multinucleare [9] o ancora tecniche del tipo imaging TOF-SIMS [10]. In questo contesto i biosensori elettrochimici giocano un ruolo decisamente innovativo ed assai promettente essendo caratterizzati da bassi costi di utilizzo e facilità di impiego. Nel presente lavoro di ricerca è stato realizzato un sensore amperometrico bienzimatico per il dosaggio della fosfocolina basato sulla co-immobilizzazione della fosfatasi alcalina e della colina ossidasi su un elettrodo di platino mediante la tecnica del co-crosslinking enzimatico. La realizzazione di un sensore bienzimatico mediante co-crosslinking è già stata riportata nel caso di un dispositivo sviluppato per la determinazione di colina ed aceticolina co-immobilizzando colina ossidasi ed acetilcolinesterasi su elettrodo di platino tal quale [11, 12] o modificato con film polimerici elettrosintetizzati [13]. Allo scopo di ottimizzare il responso del sensore nei confronti della fosfocolina si è reso necessario uno studio preliminare sulle prestazioni del biosensore al variare della fonte di fosfatasi alcalina. Tale enzima infatti idrolizza in modo non specifico monoesteri dell’acido ortofosforico a valori di pH alcalini per produrre fosfato inorganico ed un alcool, nella fattispecie colina. Sono state testate varie forme di fosfatasi alcalina, derivanti da diverse sorgenti naturali e/o diversi organi, differenti per attività enzimatica specifica, e, a parità di forma, sono stati esplorati diversi rapporti di attività dei due enzimi nella soluzione di immobilizzazione, ottenendo biosensori caratterizzati da diverse prestazioni in termini di sensibilità, valori di corrente massima, costante di Michaelis-Menten apparente e stabilità. Tra tutti i dispositivi realizzati, il biosensore che ha evidenziato le migliori performances analitiche per la fosfocolina è stato applicato all’analisi in flusso fornendo un limite di rivelabilità per colina e fosfocolina pari a 0.1 µM (S/N = 3) ed un intervallo di linearità esteso fino a 100 µM, valori più che adeguati per un futuro impiego del sensore per la determinazione della fosfocolina in campioni di interesse clinico diagnostico quali fluido cerebrospinale o omogeneizzati di tessuti. A tale scopo si è combinato il co-crosslinking enzimatico all’elettrosintesi di un film permselettivo sulla superficie elettrodica in grado di ovviare alle comuni problematiche di avvelenamento dell’elettrodo ed interferenza faradica. L’utilizzo di un rivelatore in flusso del tipo thin-layer a doppio elettrodo (configurazione parallela) [13], a colina ossidasi immobilizzata e a colina ossidasi/fosfatasi alcalina co-immobilizzate, consentirà la simultanea determinazione di colina e fosfocolina senza la necessità di ricorrere ad uno step cromatografico tipicamente richiesto per separare tali due sostanze. Riferimenti Bibliografici [1] O. H. Shin, M. H. Mar, C. D. Albright, M. T. Citarella, K. A Da Costa, S. H. Zeisel Journal of Cellular Biochemistry 64 (1997) 196-208 [2] Z. Kiss Cellular Signalling 11 (1999) 149-157 [3] Y. T. Ting, D. Sherr, H. Degani Anticancer Res 16 (1996) 1381–8 [4] R. Katz-Brull, H. Degani Anticancer Res 16 (1996) 1375–80 [5] A. Walter, U. Korth, M. Hilgert, J. Hartmann, O. Weichel, M. Hilgert, K. Fassbender, A. Schmitt, J. Klein Neurology of Agins 25 (2004) 1299-1303 [6] E. A. Pomfret, K. A. Da Costa, L. Schurman, S. H. Zeisel Analytical Biochemistry 180 (1989) 85-90 [7] S. Murai, H. Saito, R. Shirato, T. Kawaguchi Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 46 (2002) 103-109 [8] J. Murray, T. Dinh, A. Truett, D. Kennerly Biochemical Journal 270 (1990) 63-8 [9] R. Katz-Brull, R. Margalit, P. Bendel, H. Degani Magnetic Resonance materials in Biology, Physics and medicine 6 (1998) 44-52 [10] H. Nygren, K. Borner, B. Hagenhoff, P. Malmberg, J. E. Mansson Biochimica et Biophysica Acta 1737 (2005) 102-110 [11] A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin The Analyst 120 (1995) 2731-2736 [12] A. Guerrieri, F. Palmisano Analytical Chemistry 73 (2001) 2875-2882 [13] A. Guerrieri, V. Lattanzio, F. Palmisano, P.G. Zambonin Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 1710–1718
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