Dosaggio della Fosfolipasi D mediante un biosensore amperometrico a colina ossidasi modificato con polipirrolo overossidato

Le Fosfolipasi D (PLD) sono una famiglia di enzimi calcio-dipendenti in grado di catalizzare l’idrolisi del legame estereo esistente tra l’acido fosfatidico e l’entità alcolica dei fosfolipidi. Oltre ad esercitare attività idrolitica, le PLD catalizzano anche la reazione di transfosfatidilazione in presenza di una elevata concentrazione di alcool primario [1]. Sono state isolate e sequenziate PLD da varie fonti. Nei mammiferi tale enzima è coinvolto in importanti processi cellulari quali la proliferazione delle cellule stesse, la secrezione proteica e la regolazione metabolica. La maggior parte degli studi condotti sulle piante hanno riguardato i suoi possibili effetti sul deterioramento delle membrane in relazione a stress, invecchiamento e patogenesi. Nei lieviti l'attività della PLD è indispensabile alla sporulazione mentre la PLD batterica può mimare alcune reazioni che avvengono nelle cellule. Tra gli enzimi idrolitici di fonte batterica, la PLD da Streptomyces Chromofuscus è caratterizzata da una notevole capacità di transesterificazione. Tale proprietà, piuttosto insolita, è di notevole interesse pratico in quanto consente di preparare fosfolipidi non naturali utilizzati nell’industria farmaceutica e alimentare a partire dalla fosfatidilcolina. La produzione microbica di PLD trarrebbe sicuramente beneficio dalla messa a punto di una metodica di dosaggio rapida e precisa. La maggior parte delle metodiche [2, 3] esistenti per il dosaggio delle PLD riguarda la determinazione della colina (Ch) mediante blu di bromotimolo oppure per via enzimatica. Sono state inoltre descritte tecniche titrimetriche o pH-stat così come tecniche cromatografiche o in flusso accoppiate in alcuni casi alla rivelazione per fluorescenza o chemiluminescenza [4]. Il metodo più rapido e più sensibile è attualmente il dosaggio radiometrico che richiede però l’impiego di reattivi, oltre che nocivi, piuttosto costosi. Il dosaggio enzimatico delle PLD tramite biosensori a Ch è sostanzialmente inesplorato. Vrbovà et al. [5] hanno riportato, unico esempio in letteratura, la determinazione dell’attività delle PLD tramite un elettrodo di Clark modificato con una membrana in nylon co-immobilizzante colina ossidasi e catalasi. A parte le difficoltà intrinseche associate alla tecnica di immobilizzazione adottata e all’impiego di sensori ad O2, sfortunatamente gli autori non riportano alcuna figura di merito relativamente al dosaggio delle PLD né le eventuali proprietà anti-interferenti del sensore stesso. Lo scopo del presente lavoro di ricerca è stato quello di realizzare un biosensore amperometrico per il dosaggio della PLD basato sulla immobilizzazione della colina ossidasi mediante co-crosslinking enzimatico su un elettrodo di platino precedentemente modificato con un film di polipirrolo overossidato. L’immobilizzazione dell’enzima colina ossidasi mediante co-crosslinking è già stata riportata in letteratura nel caso di un sensore bienzimatico per la rivelazione di colina ed acetilcolina realizzato co-immobilizzando, con tale tecnica, colina ossidasi e acetilcolinesterasi su elettrodi di platino [6, 7]. Tale procedura è risultata estremamente promettente poiché è facilmente adattabile alla geometria dell’elettrodo di lavoro ed inoltre assicura una elevata stabilità dell’enzima e bassi tempi di risposta. La caratterizzazione elettroanalitica del biosensore in oggetto ha evidenziato un range lineare in Ch esteso fino a 0.5 mM ed un limite di rivelabilità di 1 µM. Inoltre, l’impiego del film di polipirrolo overossidato assicura una notevole permselettività consentendo la reiezione di specie interferenti usualmente presenti nelle matrici reali [8]. Al fine di ottimizzare il responso del sensore nei confronti del dosaggio enzimatico è stato condotto uno studio di taluni parametri di analisi quali la velocità di rotazione dell’elettrodo, il pH della soluzione tampone, la concentrazione di calcio e di tensioattivo e la concentrazione del substrato enzimatico. La presente metodica ha consentito di dosare la PLD in un intervallo di linearità esteso fino a 0.33 UI/ml e si è rivelata adatta per la rivelazione dell’attività enzimatica in matrici reali (ad esempio estratti vegetali crudi) fino a valori di circa 8x10-5 UI/ml in cella di analisi. [1] H. Eibl, S. Kovatchev, Methods Enzymol. 72 (1981) 633 [2] M. Heller, Adv. Lipid. Res. 16 (1978) 267 [3] A. J. Morris, M. A. Frohman, J. Engebrecht, Analytical Biochemistry 252 (1997) 1 [4] P. Rauch, E. N. Ferri, S. Girotti, H. Rauchova, G. Carrera, R. Bovara, F. Fini, A. Roda, Analytical Biochemistry 245 (1997) 133 [5] E. Vrbovà, I. Kroupovà, O. Valentovà, Z. Novotnnà, J. Kas, Analytica Chimica Acta 280 (1993) 43 [6] A. Guerrieri, G.E. De Benedetto, F.Palmisano, P.G. Zambonin, Analyst 120 (1995) 2731 [7] A. Guerrieri, F. Palmisano, Anal. Chem. 73 (2001) 2875 [8] A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Biosensors & Bioelectronics 13 (1) (1998) 103